小编： 目的：通过制备寒凝血瘀证大鼠模型，观察少腹逐瘀汤对寒凝血瘀证大鼠胸主动脉血管组织核转录因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路的影响，探讨少腹逐瘀汤对血
少腹逐瘀汤源于清代医家王清任的《医林改错》，该方由小茴香、干姜、当归、肉桂、川芎、赤芍、延胡索、没药、蒲黄、五灵脂共十味中药组成，具有活血祛瘀，温经止痛的功效，主治少腹寒凝血瘀证，是治疗妇科类疾病，如月经不调、痛经、盆腔炎、子宫内膜异位症、卵巢囊肿等的代表方剂[1,2,3]。近年来，该方还被用于治疗腹壁血栓性静脉炎、溃疡性结肠炎、糖尿病勃起功能障碍等病，并取得较好疗效[4,5,6]。现代药理研究发现，少腹逐瘀汤具有明显的抗氧化应激损伤的作用。少腹逐瘀汤中含有丰富的芳香酸类成分，如阿魏酸、烟酸、香草酸、茴香酸、咖啡酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸等，具有明显的抗氧化活性[7]。少腹逐瘀汤可明显提高子宫异位症大鼠抗氧化能力，减轻卵巢组织氧化应激损伤，缩小异位病灶体积[8]；可减轻低温诱导的内皮细胞氧化应激状态，从而抑制细胞凋亡[9]。
氧化应激是机体在遭受有害刺激时，体内产生过多的活性氧（ROS），超出细胞正常的清除能力，从而出现氧化系统和抗氧化系统失衡的状态[10]。持续的高氧化应激可导致血管内皮细胞对血管活性物质如一氧化氮（NO），血栓素A2（TXA2）等的分泌发生异常，最终引起血管内皮细胞功能紊乱和结构损伤[11]。核因子E2相关因子2（Nrf2）是氧化应激高敏性转录因子，通过核转位与细胞核内的抗氧化反应元件（ARE）结合，诱导多种Ⅱ相解毒酶如谷胱甘肽-S-转移酶、微粒体环氧化物水解酶，抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），血红素加氧酶-1（HO-1）等的转录表达，从而增加细胞抗氧化能力，在保护内皮细胞氧化应激损伤中至关重要[12,13]。
近年来，少腹逐瘀汤对寒凝血瘀证大鼠血液氧化应激水平、炎性介质分泌等的研究虽有报道，均未涉及到对血管内皮损伤保护方面的具体机制研究。同时，检测手段仅局限于血清生化指标检测上，缺乏组织病理学验证及相关调控的分子机制研究。因此，本研究通过制备寒凝血瘀证大鼠模型，初步探讨了寒凝血瘀证导致的血管内皮损伤与Nrf-2/ARE抗氧化应激信号通路的相关性。同时，验证了少腹逐瘀汤对寒凝血瘀证大鼠血管内皮损伤的保护作用，为少腹逐瘀汤对内皮损伤保护方面的科学研究提供一定的依据。
1材料
1.1动物
健康SPF级SD大鼠，50只，雌雄各半，体质量230~280g，购于亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号SCXK（吉）2018-0007。实验前，分笼饲养，适应喂养1周。所有动物实验均获黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会批准同意，编号2017101005。
1.2试剂
盐酸肾上腺素（国药集团有限公司，批号61807261）；超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），内皮素-1（ET-1），血管性血友病因子（vWF），细胞间黏附分子-1（ICAM-1），血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A001-3-2，A005-1-2，H093-1-2，H274-1-2，H065-1-2，H066-1-2）；一氧化氮（NO）测定试剂盒（北京诚林生物技术有限公司，批号E30907）；BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，蛋白上样缓冲液，兔抗大鼠Nrf2抗体，兔抗大鼠HO-1抗体，山羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记免疫球蛋白（Ig）G抗体，组蛋白（Histone）内参，β-肌动蛋白（β-actin）内参（沈阳万类生物有限公司，批号分别为WLA004，WLA013，WLA005，WL02135，WL02400，WLA023，WL0984a，WL01372）；eECL高灵敏度发光试剂盒，TBST（北京康为世纪有限公司，批号分别为CW0094T，CW0043S）；trizol，SuperM-MLV反转录酶，2×PowerTaqPCRMasterMix，SYBRGreen（北京百泰克生物技术有限公司，批号分别为RP1001，PR6502，PR1702，SY1020）；苏木素-伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司，批号G1120）。
1.3仪器
H-2050R型低温高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；LBY-N7500B型全自动血液流变仪（北京普利生仪器有限公司）；BX43型光学显微镜（日本Olympus公司）；Exicycler96型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timePCR）仪（韩国Bioneer公司）；AmershamImager600凝胶成像系统（美国GE公司）；Mini-Protean型电泳槽，MiniTrans-Blot型转印槽（美国Bio-Rad公司）；DYY-7C型电泳仪（北京六一仪器厂）。
2方法
2.1少腹逐瘀汤药液制备
方中小茴香1.5g，干姜3g，当归9g，肉桂3g，川芎6g，延胡索3g，赤芍6g，没药3g，蒲黄9g，五灵脂（炒）6g，共10味中药，购自于黑龙江中医药大学附属第一医院，经黑龙江省中医药科学院王伟明教授鉴定，符合2015版《中国药典》规定标准。全方共49.5g，放入10倍体积的水中浸泡0.5h。回流提取2次，合并两次水煎液后，浓缩至含生药浓度为4.8g·mL-1的药液。临用时加入蒸馏水稀释成所需浓度。
2.2寒凝血瘀证大鼠模型制备
SD大鼠，每天浸入直径40cm，水深20cm内壁光滑的塑料圆筒中，冰水浴温度为0~1℃，每天浸泡至大鼠全身僵直后取出，持续造模共4周。从第15天开始，大鼠给药后，隔天皮下注射盐酸肾上腺素，每天2次，给药剂量为0.8g·kg-1（0.8mL·kg-1），每次间隔时间为4h，并于两次之间将大鼠置于冰水中浸泡。造模结束后，大鼠出现血黏度显著升高，并伴有弓背竖毛、进食量减少、毛色枯槁等体征，证明模型制备成功[14]。
2.3分组及给药
50只SD大鼠，按体质量和性别随机分为空白组，模型组，少腹逐瘀汤高、中、低剂量（4.8，2.4，1.2g·kg-1）组，每组10只。实验动物给药剂量按照体表面积换算法折算，分别为人临床等效剂量的1，0.5，0.25倍。除空白组外，其余各组造模同时开始灌胃给药。连续给药4周。最后1次造模后禁食不禁水，并于次日给药1h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主动脉采血及分离胸主动脉，进行各项指标测定。
2.4血液流变学指标检测
腹腔注射5%水合氯醛（7mL·kg-1）麻醉，含肝素钠的采血管中收集全血4mL，全自动血液流变仪测定10s-1，30s-1，200s-1切变率下全血黏度；3000r·min-1离心10min，离心半径8.3cm，分离血浆，测定血浆黏度。
2.5血清生化指标检测
不含抗凝剂的真空采血管收集全血4mL，低温高速离心机3000r·min-1离心10min，离心半径8.3cm，分离血清，分装后冰箱冻存。酶联免疫试剂盒测定血清中NO，ET-1，vWF，VCAM-1，ICAM-1，SOD，GSH-Px含量，根据说明书要求进行操作。
2.6HE染色检测胸主动脉血管组织病理变化
末次给药后，分离胸主动脉，置于4%多聚甲醛缓冲液中，固定过夜。胸主动脉经常规石蜡包埋，切片，依次用二甲苯脱腊、无水乙醇脱水、苏木素染色、伊红染色、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。最后，置于光镜下观察胸主动脉内病理变化情况。
2.7Real-timePCR检测胸主动脉血管组织Nrf2，HO-1mRNA表达
准确称取大鼠胸主动脉组织5mg，放入无RNA酶的玻璃匀浆器中，加入trizol1mL，充分匀浆后，室温静置5min。按照trizol总RNA提取试剂盒说明书操作提取样本总RNA。紫外分光光度计测定总RNA在260nm和280nm波长下的吸光度值A，以计算浓度。应用SuperM-MLV反转录酶试剂盒进行cDNA的合成。应用2×PowerTaqPCRMasterMix试剂盒进行PCR反应。PCR反应体系为上下游引物各0.5μL，2×MasterMix10μL，cDNA模板1μL，ddH2O8μL。反应条件为预变性95℃5min，1个循环。变性95℃30s；退火60℃20s；延伸72℃30s，40个循环。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法分析目的mRNA相对表达水平。各引物由沈阳万类生物有限公司合成，引物序列见表1。 表1引物序列导出到EXCEL Table1Primersequence 引物序列长度/bpNrf2上游TCTGACTCCGGCATTTCACT161 下游TGTTGGCTGTGCTTTAGGTC HO-1上游CGAAACAAGCAGAACCCA192 下游CACCAGCAGCTCAGGATG β-actin上游GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC155 下游GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT
2.8蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测胸主动脉血管组织Nrf2，HO-1蛋白表达
取胸主动脉血管组织50mg，液氮速冻后，剪成碎块，置于遇冷的EP管中，加入加强型RIPA裂解液0.5mL，冰浴中裂解30min。12000r·min-1离心10min，离心半径8.5cm，分离上清。采用BCA法测定总蛋白浓度。蛋白煮沸变性后，以每孔40μg蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离目的蛋白。湿转法转膜。5%封闭奶粉室温封闭1h后，一抗（Nrf2，HO-1，1:500）4℃孵育过夜。二抗（1:1万）室温孵育2h后，滴加eECL发光试剂300μL覆盖膜表面。置于在凝胶成像系统中，避光反应3min，曝光成像。以β-actin为内参蛋白，应用ImageJ软件分析各条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。
2.9统计分析方法
采用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料以`x±s表示，多组间比较采用One-wayANOVA，P<0.05表示差异有统计学意义。
3结果
3.1对各组大鼠血液流变学指标的影响
与空白组比较，模型组全血黏度（高、中、低切变率）及血浆黏度均明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，少腹逐瘀汤高、中剂量组全血黏度（高、中切变率）及血浆黏度均明显降低（P<0.05），少腹逐瘀汤低剂量组有降低的趋势，但与模型组比较差异无统计学意义。见表2。 表2少腹逐瘀汤对各组大鼠血液黏度的影响（`x±s，n=10）导出到EXCEL Table2EffectofShaofuZhuyutangonbloodviscosityofratsineachgroup(`x±s，n=10) 组别剂量/g·kg-1全血黏度/mPa·s血浆黏度/mPa·s10s-130s-1200s-1空白-7.89±2.154.55±0.963.82±0.371.09±0.04模型-10.06±2.271)5.45±0.632)4.38±0.392)1.16±0.042)少腹逐瘀汤4.88.92±1.964.91±0.483)4.03±0.263)1.10±0.023) 2.48.51±1.024.85±0.213)4.04±0.173)1.12±0.033) 1.29.94±2.875.26±0.634.16±0.311.14±0.02 注：与空白组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01（表3~6同）。
3.2对各组大鼠血清中vWF，ICAM-1，VCAM-1含量的影响
与空白组比较，模型组中vWF，ICAM-1，VCAM-1含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，少腹逐瘀汤高、中、低剂量组vWF含量均明显降低（P<0.05，P<0.01），高、中剂量组ICAM-1，VCAM-1含量均明显降低（P<0.05，P<0.01），低剂量组各指标有降低的趋势，但与模型组比较，差异无统计学意义。见表3。 表3少腹逐瘀汤对各组大鼠血清中vWF，ICAM-1，VCAM-1含量的影响（`x±s，n=10）导出到EXCEL Table3EffectofShaofuZhuyutangonlevelsofvWF，ICAM-1，VCAM-1inserumofratsineachgroup(`x±s，n=10) 组别剂量/g·kg-1vWF/U·L-1ICAM-1/μg·L-1VCAM-1/μg·L-1空白-293.68±20.0992.71±25.9522.76±2.79模型-356.93±38.202)133.79±20.342)28.95±2.642)少腹逐瘀汤4.8311.89±32.274)111.35±18.723)24.09±2.354) 2.4322.91±38.353)114.52±18.993)26.46±2.163) 1.2324.06±35.463)119.38±23.6127.11±0.18
3.3对各组大鼠血清中NO，SOD，GSH-Px，ET-1含量的影响
与空白组比较，模型组NO，SOD，GSH-Px含量显著降低（P<0.01），ET-1的含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，少腹逐瘀汤各组NO，SOD，GSH-Px含量明显升高（P<0.05，P<0.01），少腹逐瘀汤高、中剂量组ET-1含量明显降低（P<0.05，P<0.01），低剂量组ET-1含量有降低的趋势，但与模型组比较差异无统计学意义。见表4。 表4少腹逐瘀汤对各组大鼠血清中NO，SOD，GSH-Px，ET-1含量的影响（`x±s，n=10）导出到EXCEL Table4EffectofShaofuZhuyutangonlevelsofNO，SOD，GSH-Px，ET-1inserumofratsineachgroup(`x±s，n=10) 组别剂量/g·kg-1NO/μmol·L-1ET-1/μg·L-1SOD/μg·L-1GSH-Px/μg·L-1空白-1.76±0.46199.86±27.233.63±0.8436.93±7.57模型-0.99±0.252)252.30±36.632)2.25±0.492)26.13±4.362)少腹逐瘀汤4.81.59±0.603)208.09±25.934)3.35±0.874)34.63±6.324) 2.41.47±0.593)220.18±31.123)2.92±0.833)32.82±5.254) 1.21.30±0.463)224.12±33.722.81±0.633)31.11±6.203)
3.4对各组大鼠胸主动脉血管组织病理变化的影响
光镜下空白组大鼠胸主动脉血管内膜光滑，内膜下细胞排列整齐，内弹力层和中层平滑肌层次分明。模型组大鼠主动脉血管染色不均，内皮细胞增生、肿胀、脱落，内弹力膜断裂，平滑肌排列紊乱。少腹逐瘀汤各给药组，胸主动脉血管内皮细胞肿胀程度降低、脱落减少、平滑肌细胞排列有所改善，病理损伤程度有所改善。见图1。 图1少腹逐瘀汤对各组大鼠胸主动脉血管组织的影响（HE，×200） 下载原图 Fig.1EffectofShaofuZhuyutangonvasculartissueofthoracicaorticofratsineachgroup(HE，×200) A.空白组；B.模型组；C.少腹逐瘀汤高剂量组；D少腹逐瘀汤中剂量组；E.少腹逐瘀汤低剂量组
3.5对各组大鼠胸主动脉血管组织Nrf2，HO-1mRNA表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠胸主动脉血管组织Nrf2，HO-1mRNA表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，少腹逐瘀汤高、中剂量组的Nrf2mRNA表达显著升高（P<0.01），高、中、低剂量组HO-1mRNA的表达显著升高（P<0.01）。见表5。 表5少腹逐瘀汤对各组大鼠胸主动脉血管组织Nrf2，HO-1mRNA表达的影响（`x±s，n=6）导出到EXCEL Table5EffectofShaofuZhuyutangontheexpressionofNrf2andHO-1mRNAinvasculartissueofthoracicaorticofratsineachgroup(`x±s，n=6) 组别剂量/g·kg-1Nrf2HO-1空白-1.00±0.051.00±0.06模型-1.08±0.062)1.79±0.272)少腹逐瘀汤4.81.23±0.104)4.44±0.344) 2.41.18±0.054)2.69±0.304) 1.21.12±0.082.20±0.314)
3.6对各组大鼠胸主动脉血管组织Nrf2、HO-1蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组的细胞核内的Nrf2的蛋白表达明显升高（P<0.05），细胞浆中Nrf2的蛋白表达水平明显降低（P<0.05），HO-1的蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，少腹逐瘀汤高、中、低剂量组细胞核Nrf2的蛋白表达显著升高（P<0.01），细胞浆Nrf2的蛋白表达显著降低（P<0.01），HO-1蛋白表达显著升高（P<0.01）。见图2，表6。 图2少腹逐瘀汤对各组大鼠胸主动脉血管组织Nrf2，HO-1蛋白表达的影响 下载原图 Fig.2EffectofShaofuZhuyutangonexpressionofNrf2andHO-1proteinsinvasculartissueofthoracicaorticofratsineachgroup A.空白组；B.模型组；C.少腹逐瘀汤高剂量组；D少腹逐瘀汤中剂量组；E.少腹逐瘀汤低剂量组 表6少腹逐瘀汤对各组大鼠胸主动脉血管组织Nrf2，HO-1蛋白表达的影响（`x±s，n=6）导出到EXCEL Table6EffectofShaofuZhuyutangonexpressionofNrf2andHO-1proteinsinvasculartissueofthoracicaorticcellsofratsineachgroup(`x±s，n=3) 组别剂量/g·kg-1细胞核Nrf2/β-actin细胞浆Nrf2/β-actinHO-1/β-actin空白-1.01±0.051.00±0.041.00±0.03模型-1.92±0.072)0.82±0.081)2.07±0.172)少腹逐瘀汤4.85.30±0.194)0.23±0.054)5.28±0.184) 2.43.90±0.144)0.45±0.094)3.32±0.234) 1.22.82±0.104)0.59±0.064)2.74±0.184)
4讨论
寒冷是一种常见的应激源和致病因素，能够使机体内氧化还原稳态失衡，产生大量的活性氧（ROS），导致组织器官损伤[15]。同时，寒冷应激还会刺激机体分泌大量的肾上腺素，使血管强烈收缩，引起血压升高、血液剪切应力增加，导致血管壁机械性损伤[16]。当血管损伤时，受损组织会释放炎症因子和凝血酶组织因子，作用于炎性细胞产生炎性反应，激活纤维蛋白原和血小板，形成血栓。同时，内皮细胞损伤引起细胞因子释放、黏附因子大量分泌、血管通透性增加、血管平滑肌细胞增生，使血流阻力增加、血液流动性降低、血液呈高黏滞状态[17]。本实验研究发现，寒凝血瘀证大鼠全血黏度、血浆黏度显著增高，血液呈现高黏状态。少腹逐瘀汤治疗后，各组大鼠全血黏度、血浆黏度显著降低。表明，少腹逐瘀汤具有降低寒凝血瘀证大鼠血黏度的作用，这与以往研究结果相一致[18]。
血管内皮细胞不仅是血管和血液之间的屏障，还是一个分泌器官。其可以通过内分泌、旁分泌及外分泌的方式合成和释放多种的生物活性物质，参与不同的生理及病理过程。NO是一种血管舒张因子，能够在血管内皮细胞合成并释放，具有舒张血管平滑肌、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板黏附、聚集的作用[19]。ET-1是最强的血管收缩活性物质，通过调节Serine177介导Rab11A磷酸化，抑制辅助β1亚基转移，产生收缩血管作用[20]。vWF是在内皮细胞Weibel-Palade小体中合成分泌的具有黏附功能的一种糖蛋白，其表达升高能够促进血小板在受损的血管内皮下黏附并聚集，诱发血栓的形成[21]。ICAM-1，VCAM-1是血管内皮细胞分泌具有细胞黏附功能的免疫球蛋白，参与调节炎症反应、免疫应答等过程、其高表达可促进白细胞和血管内皮间的黏附、浸润，使内皮细胞损伤进一步加重[22]。本实验研究发现，模型组大鼠胸主动脉内皮细胞增生、肿胀、脱落，平滑肌排列紊乱。少腹逐瘀汤组大鼠胸主动脉内皮细胞肿胀程度降低、脱落减少、平滑肌细胞排列有所改善。同时，模型组大鼠血清中ET-1，ICAM-1，VCAM-1含量显著升高，NO含量显著降低。少腹逐瘀汤组大鼠血清中ET-1，ICAM-1，VCAM-1含量显著降低，NO含量显著升高。表明，寒冷应激结合皮下注射肾上腺素能够造成血管内皮细胞损伤，而少腹逐瘀汤对血管内皮细胞损伤具有保护作用，作用机制与抑制黏附因子分泌有关。
当血管内皮细胞氧化应激损伤时，可通过不同途径激活细胞内各种抗氧化相关信号通路，修复氧化应激导致的细胞损伤，促进细胞存活。Nrf2是氧化应激高敏感性转录因子，位于细胞骨架，与Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）相邻。在生理条件下，Nrf2通过DLG结构域与Keap1的Kelch结构域相互作用，形成异源二聚体，降低Nrf2的转录活性。氧化应激可导致Nrf2的IVR结构域诱导构象变化，Nrf2与Keap1分离进入细胞核与ARE结合，从而转录翻译П相代谢酶和抗氧化酶等相关靶基因，发挥抗氧化损伤功能[23,24]。本实验研究发现，与模型组比较，少腹逐瘀汤组大鼠胸主动脉Nrf2和HO-1mRNA表达量上调，Nrf2（细胞核）和HO-1蛋白表达升高、血清中SOD，GSH-Px含量显著升高。表明，少腹逐瘀汤可诱导Nrf2的细胞核转位，促进抗氧化酶SOD，GSH-Px，HO-1的转录表达，从而预防寒冷刺激联合肾上腺素导致的血管内皮损伤。
[责任编辑孙丛丛]
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